近日，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學課題組在基因蛋白表達水平的雙向定量調控領域取得了重要突破。相關成果以“Precise genome editing of the Kozak sequence enables bidirectional and quantitative modulation of protein translation to anticipated levels without affecting transcription”為題在線發(fā)表于Nucleic Acids Research（核酸研究）雜志。該研究以蛋白翻譯調控元件—Kozak序列為切入點，開發(fā)出一種全新的、普適的策略，用于精細調控目標基因蛋白表達水平。這種策略在不觸及基因轉錄的情況下，既能實現蛋白表達水平的雙向（上調或下調）調控，又能將蛋白表達水平控制在預測范圍內。

　　基因的表達包括轉錄和翻譯兩個過程，其表達水平的調控可以在多個層面上進行，包括基因組、轉錄、翻譯等層面。過去的研究已經對調控基因表達進行了大量探索，并取得了許多重要的進展。例如，通過使用基因編輯工具對基因序列進行編輯，引入移碼突變或破壞起始密碼子等，可以實現目標基因的完全敲除；利用組成型啟動子或組織特異性啟動子，可以實現目標基因的過量表達；利用RNA干擾技術或CRISPR/Cas9激活或抑制系統，可以實現目標基因的激活或抑制。然而，這些策略只能實現目標基因的完全敲除或將目標基因的表達量調控到不可預測的水平，而不能實現目標基因的可預測定量調控。

　　在真核細胞的mRNA中，非翻譯區(qū)（Untranslated Region，UTR）存在調控基因翻譯的元件，如Kozak序列、上游開放閱讀框（Upstream Open Reading Frame, uORF)等。有課題組針對uORF進行設計，建立了精細上調或下調內源基因翻譯的方法，并成功應用到植物分子設計育種領域。但該策略無法定量地將蛋白表達控制在特定水平。Kozak序列是翻譯起始附近的序列，對于核糖體正確識別翻譯起始密碼子具有直接關系，其序列的不同，會導致蛋白合成量的差異，這提示了通過改造基因Kozak序列可能獲得不同翻譯效率的調控效果。

　　因此，該研究基于對編碼基因Kozak序列的精確操作，提出了一種名為KZ3-edit的新型基因表達調控策略：利用精準基因編輯技術在DNA水平上精確修飾起始密碼子上游的3個核苷酸（這是Kozak序列的一部分，堿基偏好最顯著，被命名為KZ3），這足以高效調控基因的翻譯效率。在不改變基因的轉錄水平和蛋白質序列的情況下，對mRNA的翻譯水平進行定量和雙向調控，從而將蛋白表達精細地控制在預期的水平。通過體外雙熒光報告系統、綠色熒光細胞系及內源基因三個層面，研究人員驗證了KZ3-edit策略的有效性和靈活性，并證實通過精準基因編輯工具對基因主效開放閱讀框（Primary Open Reading Frame, pORF）或uORF起始密碼子上游KZ3序列的單個堿基改變或堿基組合轉變，可以實現特定基因翻譯水平的高效調控。

　　此外，研究人員還將該策略應用于家兔生物性狀的調控，分別以調節(jié)脂質代謝的PCSK9基因和調控毛發(fā)生長周期的HR基因為靶基因。一方面，通過改變PCSK9基因的pORF的KZ3序列來直接降低PCSK9蛋白表達量，成功構建了低膽固醇家兔模型；另一方面，通過修飾HR基因的uORF—U2HR，改變其KZ3序列而間接上調HR基因的蛋白表達量，成功構建了遺傳性少毛癥家兔模型。這兩種家兔模型的成功構建為KZ3-edit策略在基因的精細調控中的應用，以獲得目標生物性狀提供了范例。

　　該研究提出了一種普適、高效、靈活的基因翻譯調控新策略，可以對目標基因起始密碼子前三個堿基進行直接基因編輯，從而實現雙向定量調控目標基因翻譯水平的效果。這種策略理論上可以應用于真核生物所有的編碼基因，且該策略調控翻譯的有效性、設計簡便性以及應用多樣性將為基因功能研究、人類遺傳疾病模型構建與治療、農業(yè)精準分子設計育種等提供重要的技術手段。

　　本研究中，廣州健康院謝精科副研究員、莊鎮(zhèn)鵬博士和茍士學博士為共同第一作者，王可品研究員和賴良學研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、海南省科技計劃、廣東省科技計劃、中國科學院青年創(chuàng)新促進會等項目的資助。

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KZ3-edit策略原理圖